Sử khác nhau giữa phương pháp đông lạnh và đông khô trong bảo quản giống vi sinh vật

Năm 2020

Sheraton Saigon Hotel & Towers, Thứ bảy, ngày 16 tháng 07 năm 2022 ...

16:11 26/03/2021

           Đông khô là công nghệ tiên tiến nhất hiện nay trong bảo quản các chủng vi sinh vật giúp gia tăng độ ổn định, kéo dài thời gian bảo quản và hạn chế được sự thay đổi các đặc tính di truyền của vi sinh vật. Là phương pháp cần thiết cho quá trình bảo quản chủng giống.

           Đông khô vi sinh vật là quá trình tách nước ra khỏi tế vi sinh vật ở trạng thái lạnh qua hệ thống thiết bị theo hai bước cụ thể:

  1. Đầu tiên vi sinh vật được làm huyền phù trong môi trường thích hợp, sau đó được giữ trong điều kiện lạnh sâu (-70oC) để đóng băng vi sinh vật. Ở giai đoạn đầu làm khô, nước đã đóng băng được loại bỏ khỏi mẫu thông qua quá trình thăng hoa bằng cách giảm áp suất chân không trong buồng sấy đến một giá trị thấp hơn áp suất bay hơi của nước để nước chuyển từ mẫu sang bình ngưng. Môi trường chân không làm đẩy nhanh quá trình thăng hoa của nước. Khoảng 95% lượng nước trong mẫu được loại bỏ ở giai đoạn này.
  2. Sau khi loại bỏ phần lớn lượng nước, giai đoạn làm khô tiếp theo (tách ẩm) nhằm loại bỏ độ ẩm còn sót lại trong mẫu bằng cách tăng nhiệt độ cao hơn giai đoạn đầu. Độ ẩm của mẫu lúc này chỉ khoảng 1-5%. Sau đó, mẫu sẽ được hàn kín để đảm bảo mẫu được giữ trong môi trường chân không nhằm tăng thời gian bảo quản.

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học sở hữu hệ thống thiết bị đông khô hiện đại nhập khẩu từ Đức, cùng đội ngũ cán bộ chuyên môn sâu về vi sinh vật đang từng bước hoàn thiện quy trình đông khô vi theo hệ thống quản lý chất lượng ISO 9001:2015. Chúng tôi nhận đông khô các chủng vi sinh vật cho tất cả các cơ sở đào tạo, nghiên cứu và doanh nghiệp trong cả nước.

           Hoạt động đông khô chủng giống vi sinh vật được thực hiện tại Trung tâm Nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia (VTCC). Cá nhân/tổ chức có nhu cầu, xin vui lòng liên hệ theo thông tin dưới đây:

  Địa chỉ:               Tầng 5, nhà E2, 144 đường Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội

  Điện thoại:        +84 243 7547407 (502)


  • Các phòng chức năng
  • Văn bản & quy chế đào tạo
  • Phòng thí nghiệm

>>> Xem thêm Thư viện Hình ảnh sản phẩm sấy khô

Sấy khô vi sinh vật hay chính là sấy men vi sinh, các loại men chứa nhiều loại vi sinh vật theo từng mục đích sử dụng như men vi sinh cho đường ruột, men tiêu hóa, men sữa chua, hay thậm chí là dạng men rượu…Tuy nhiên men vi sinh được hiểu là men cung cấp các loại vi sinh vật có lợi cho đường ruột, nhằm tạo ra sự cân bằng giữa vi sinh vật có lợi và có hại trong đường ruột, hay còn gọi là lợi khuẩn và hại khuẩn, nếu mất cần bằng sẽ không tốt. Trong nội dung này chúng ta cùng tìm hiểu về phương pháp đông khô vi sinh vật.

Sử khác nhau giữa phương pháp đông lạnh và đông khô trong bảo quản giống vi sinh vật

Chúng ta thường thấy men vi sinh có dạng bột, được đóng trong các túi nhỏ, khi sử dụng cần pha nước mát để uống, tác dụng giúp hệ thống tiêu hóa ổn định hơn, khỏe mạnh hơn. Mặc dù men vi sinh có nhiều lợi ích, cung cấp vi sinh vật có lợi, tuy nhiên việc sử dụng cần phải có chỉ định của bác sỹ bởi hệ vi sinh vật trong đường ruột là cần phải có sự cân bằng. Trong quá trình sản xuất men vi sinh, phương pháp đông khô vi sinh vật là giai đoạn quyết định tới chất lượng của men vi sinh, sấy khô dung dịch men sau quá trình điều chế. Vậy sấy đông khô là gì, chúng ta nên tìm hiểu về phương pháp này để biết được chất lượng sản phẩm sẽ ra sao khi sử dụng phương pháp này.

Trong lĩnh vực sấy khô, hàng nghìn thứ cần sấy khô, trong dân dụng, trong công nghiệp, trong nghiên cứu, trong y học, trong dược phẩm….rất nhiều sản phẩm cần sấy khô. Trong đó, men vi sinh là một trong những sản phẩm rất khó sấy, thuộc nhóm khó sấy khô mà vẫn bảo đảm chất lượng của sản phẩm. Các nhóm sản phẩm cần sấy khô có thể được chia làm một số nhóm cơ bản như nhóm rất dễ sấy khô, nhóm dễ sấy, nhóm khó sấy và nhóm rất khó sấy khô, thêm nữa là nhóm sản phẩm dân dụng và nhóm sản phẩm công nghiệp. Cách gọi ” sấy khô” ở đây không những là khô mà phải đạt yêu cầu, do đó mỗi nhóm sản phẩm trên sẽ tương ứng với máy sấy phù hợp, như máy sấy dân dụng, máy sấy công nghiệp, máy sấy lạnh, máy sấy thăng hoa….

Men vi sinh thuộc nhóm rất khó sấy khô, yêu cầu sấy phải đảm bảo đạt độ khô cao, tơi, xốp, bột, không co ngót, không vón cục, đảm bảo vi sinh vật không bị ảnh hưởng, không chết vi sinh vật. Phương pháp đông khô vi sinh vật chính là sấy khô ở nhiệt độ âm, hoặc ít nhất phải dưới 20oC, đó chính là phương pháp sấy thăng hoa mà chúng ta đã biết. Sấy đông khô là tên gọi khác, mọi sản phẩm phải được đông lạnh trước khi sấy để đảm bảo sản phẩm không bị co ngót, kết cấu khô tơi xốp, giữ nguyên mọi đặc điểm ban đầu của sản phẩm.

Nhìn chung, những sản phẩm thuộc nhóm rất khó sấy khô như men vi sinh, men sữa chua, cao dược liệu, bột tảo xoắn, nấm đông trùng hạ thảo, hoa trà vàng, nụ hoa hồng….đều cần tới sấy thăng hoa. Phương pháp đông khô vi sinh vật chính là sấy đông khô, như vậy phương pháp này cũng không có gì mới mẻ và phức tạp, sử dụng đúng thiết bị sấy khô là đảm bảo chất lượng, Khách hàng cần tư vấn kỹ càng hơn hãy liên hệ đến hãng Mactech để được cung cấp thêm nhiều thông tin hữu ích, cảm ơn các Bạn đã tham khảo nội dung chia sẻ.

         Trong phần này chúng tôi giới thiệu cụ thể một số phương pháp thông dụng nhất.

Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời gian dài.

         Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh).

         Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log.

         Có thể dùng một trong hai loại đệm sau:

         + Đệm huyết thanh- inositol;

                   Meso-inositol:     5 gam

                   Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml

                   Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các bình vô trùng.

         + Đệm inositol:

         Môi trường dinh dưỡng bột số 2:  2.5 gam

         Meso-inositol: 5 gam

         Nước cất: đủ 100 ml.

         Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121OC.

         Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm với các vi sinh vật có bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường hợp enterobacteria thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn.

         Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp thông thường.

         Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml. Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô.

         Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá. Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng 3 giờ.

         Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết thắt được thực hiện với hệ thống đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn và tạo vết thắt trên thiết bị tự động.

         Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt khoảng 1%. Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 1-2 giờ.

         Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và cẩn thận. Trước hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực hiện thao tác hàn ống đông khô.

         Người ta sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm.

         Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản. Việc đếm được thực  hiện trước khi và ngay sau khi đông khô. Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm. Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy.

         Mẫu thông thường được bảo quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng.

b.     Phương pháp giữ trong lạnh sâu:

1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu:

         Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.

         2, Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106.

         3, Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống bị rò rỉ).

         Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng.

         Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3 OC/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15 OC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100OC đến -80 OC). Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh sâu được chương trình hoá với tốc độ mong muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban đầu được đặt trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ -65OC.

         4, Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37 OC trong 40-60 giây). Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản.

         c. Một số phương pháp bảo quản khác:Bảo quản trên gelatin và silicagel.

         Xạ khuẩn mang cả đặc tính của vi khuẩn và nấm sợi (có sợi và bào tử) do đó cần có những phương pháp bảo quản thích hợp.

         Thông thường xạ khuẩn cũng được bảo quản theo các cách thông thường như cấy truyền, đông khô và lạnh sâu như với vi khuẩn ở trên. Tuy nhiên, có phương pháp kinh tế mà vẫn đảm bảo chất lượng chủng bảo quản mà chúng tôi trình bày ở đây, đó là phương pháp bảo quản trong đất.

         Các bước tiến hành bảo quản trong đất:

         1, Chuẩn bị đất: lấy đất vườn làm khô tại 150 OC trong 6 giờ để làm chết các vi sinh vật có bào tử và trứng giun nếu có. Đất sau khi thanh trùng được nghiền nhỏ qua lưới có kích thước 30 mesh. Đất sau khi nghiền được đưa vào ống nghiệm chuẩn bị nút bông và thanh trùng trong 60 phút. Trước khi tiến hành bảo quản phải kiểm tra nhiễm sự khuẩn trong đất bằng cách cấy vòng que cấy đất từ ống nghiệm đặt vào môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn và giữ ở 24 OC, 28 OC và 37 OC, kiểm tra sau 2-4 ngày.

         2, Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn. Nước cất vô trùng được dùng để tạo dịch huyền phù xạ khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng. Lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi ống nghiệm và để khô tại nhiệt độ phòng (24OC) trong thời gian 1 tháng. Đập nhẹ vào thành ống cho các hạt tách đều ra và bảo quản mẫu tại 4OC.

         3, Hoạt hoá mẫu đơn giản bằng cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch hoặc dịch thể) và để ở nhiệt độ thích hợp.

         Vi tảo thông thường được bảo quản theo 3 phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu và đông khô. Các phương pháp đã được trình bày chi tiết trong phần vi khuẩn. Một số điểm cần chú ý khi bảo quản vi tảo là ở chỗ: Nên dùng tế bào già ở pha cân bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết quả tốt hơn phương pháp đông khô.

         a. Phương pháp cấy truyền:

         Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các chủng nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau đó là quá trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ được bảo quản theo các cách khác nhau:

-         Các ống thạch được để trong tủ lạnh (4-7 OC).

-         Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối là 0.83- 0.89 đã được khử trùng ở nhiệt độ 121 OC trong 15 phút. Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng 1 cm. Nhiệt độ bảo quản là 15-20 OC.

-         Bảo quản trong nước, nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch đĩa. Sau khi sợi phát triển cực đại thì cắt thành từng miếng nhỏ kích thước khoảng 6 mm2 và cho vào lọ nước đã thanh trùng. Bảo quản tại nhiệt độ phòng.

b.     Bảo quản nấm sợi có bào tử trong silicagel:

Chuẩn bị:

1, Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) thanh trùng ở nhiệt độ 170 OC trong 3 giờ.

2, Silicagel: Loại trong suốt, không có màu, kích thước và số lượng hạt silicagel đưa vào không quá 1/3 thể tích của lọ, thanh trùng ở nhiệt độ 170 °C trong 3 giờ.

3, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút).

4, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).

Cách tiến hành:

         1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).

         2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel. Chú ý silicagel hút nước và sinh nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải được thực hiện trong chậu nước đá. Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt quá 1/3 thể tích hạt silicagel trong lọ. Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạt silicagel đều dính dịch bào tử nấm sợi. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp...

         3, Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau đó giữ trong bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC trong 1 tuần. Vặn chặt nút và quấn giấy parafil giữ trong 4OC.

         Kiểm tra độ sống sót sau khi bảo quản:

         Mẫu silicagel ở 4 °C, dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên mặt thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường. Để ở nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp.

c.      Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez-drying):

Chuẩn bị:

         1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170OC trong 3 giờ.

         2, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút).

         3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).

         Cách tiến hành:

         1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).

         2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 - 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc.

         3, Giữ ở -80°C trong 3 giờ trước khi tiến hành đông khô, đồng thời bật máy Dura-Stop, khi nhiệt độ đạt -40OC, đưa mẫu vào tủ đông khô của Dura-Stop, bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt độ Dura-Stop lên -5OC, để qua đêm.

         4, Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25°C, khi đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không nhưng không tắt Dura-Dry.

         5, Tắt Dura-Stop, lần lượt nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy Dura-Dry, tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55OC.

         Chú ý: Trong trường hợp chỉ dùng Dura-Dry có thể được thực hiện như sau:

-         Tiến hành các bước 1,2,3,4 như trên.

-         Mẫu được để tiền đông khô ở -80°C trong 3 giờ. Bật máy Dura-Dry, khi đạt nhiệt độ -60oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC.

Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô:

         1, Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột ngột bằng cồn đốt.

         2, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan đều mẫu đông khô. Hút toàn bộ dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất. Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau (mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp và nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một hướng như hình vẽ:

 

Sử khác nhau giữa phương pháp đông lạnh và đông khô trong bảo quản giống vi sinh vật

         3, Sau đó đậy nắp đĩa, bao quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ thích hợp.

         4, Cách đánh giá:

         Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc.

         Khá:      50 – 100 khuẩn lạc.

         Trung bình: 10-50 khuẩn lạc.

         Kém:   < 10 khuẩn lạc.

          Không mọc.

          Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên. Tuy nhiên, có một số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá như sau: Nếu các khuẩn lạc mọc đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt. Mẻ đông khô là thành công nếu như số khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường trong đĩa petri. Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi đông khô như thay đổi môi trường sinh bào tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi.

d.     Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp:

Phương pháp đông khô trực tiếp thực hiện tương tự như phương pháp đông khô đã trình bày ở trên và được thực hiện như sau:

Chuẩn bị:

1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170oC trong 3 giờ.

2, Môi trường L-drying chuẩn có thành phần như sau:

         Đệm phosphat:  0.1M : 100 ml.

         Monosodium glutamat: 3 g

                   Adonitol: 1.5 g.

                  (Khử trùng ở 115oC/20 phút).

         3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).

         Cách tiến hành:

         1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường đã thanh trùng ở trên cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).

         2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc.

         3, Đồng thời bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -75oC, lần lượt nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không khi nối ampoule mẫu với tube manifold sau đó lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết khi làm đông khô phải lần lượt đưa mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị cho phép). Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC tiến hành quá trình làm khô trong 3 giờ.

         4, Hàn kín ampoule mẫu:

         Khi máy cô Dura-Dry đang chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần lượt khoá van cho từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với các mẫu này tại vị trí ống bị thắt. Dùng ngọn lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho đều các phía và xoay đều cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống. Sau đó dùng ngọn lửa gas để cắt rời phần trên (nối với manifold) và phần dưới chứa mẫu. Hết đợt lại khoá các van của các ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần lượt như trên.

         Kiểm tra chất lượng ngay sau khi bảo quản:

-         Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện theo cách đã được mô tả ở phần đông khô.

-         Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích hợp và quan sát hình thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả năng tạp nhiễm và đặc tính sinh học.

-         Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các mẫu sau đông khô trực tiếp được giữ ở 37oC trong 2 tuần. Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm trong 2 tuần ở 37oC tương đương với bảo quản 10 năm ở 4oC.

e. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80 o C và nitơ lỏng (-196 o C):

Chuẩn bị:

1, Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml trong ống nghiệm) khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. Ống nhựa nút xoáy (2 ml), rửa sạch trong sonic cleaner, khử trùng ở 170 oC trong 3 giờ.

         2, Chuẩn bị mẫu nấm sợi trên môi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn.

         Cách tiến hành:

         1, Dùng pipet pasteur hút khoảng 0,3 ml glycerol đã thanh trùng vào ống nhựa đựng mẫu. Sau đó dùng dao vô trùng cắt lấy 1 miếng nhỏ môi trường chứa cả sợi và bào tử nấm sợi cho vào ống nhựa. Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút và bao băng parafil sau đó dán nhãn.

         2, Mẫu trước tiên phải để ở 5oC (tạo điều kiện cho glycerol đi vào tế bào), sau đó được làm lạnh sâu tử 25oC xuống -55oC với tốc độ -1oC/phút. Trong trường hợp không có thiết bị làm lạnh thì có thể để -20oC trong 3 giờ, sau đó chuyển sang -80oC hay nitơ lỏng (-196oC).

         Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết các nấm sợi sinh bào tử và tế bào có vách ngăn. Nhưng phương pháp này tỏ ra không thích hợp với các nấm sợi không sinh bào tử và không có vách ngăn. Trong trường hợp này cần nuôi cấy nấm sợi trên môi trường thích hợp để tạo bào tử. Nếu không khắc phục được thì phải tiến hành nuôi trên môi trường dịch thể để thu lấy sinh khối và giữ trong glycerol 10% như trên.

         Đánh giá khả năng sống của mẫu bảo quản:

         1, Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu -80oC hoặc nitơ lỏng -196oC) trong bể ổn nhiệt 37oC trong 2 phút.

         2, Dùng que cấy lấy các miếng môi trường thạch đặt vào 3 vị trí khác nhau trên môi trường thạch đĩa thích hợp. Để ở nhiệt độ thích hợp và xem khả năng mọc sau thời gian thích hợp (2-4 ngày). Chú ý khi lấy mẫu cần lấy cả sợi nấm để đưa vào môi trường thạch đĩa.

         Một số điều chú ý đối với bảo quản nấm sợi:

-         Ảnh hưởng của ánh sáng với quá trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp thì sự thành công của phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử. Ánh sáng là một tác nhân quan trọng đối với quá trình hình thành bào tử của nấm sợi, ánh sáng có bước sóng ngắn có tác dụng kích thích quá trình hình thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím (3100 – 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc và kích thước khuẩn lạc.

-         Thành phần môi trường: Nói chung các môi trường có thành phần dinh dưỡng nghèo thì thường cho lượng bào tử lớn.

-         Tránh nhiễm tạp các con mạt (mite), các chủng nấm sợi lưu giữ thường bị mạt phá hoại. Đầu tiên chúng ăn chủng giống và làm hỏng, sau đó gây tạp nhiễm do mang bào tử và vi khuẩn trên cơ thể từ ống này sang ống khác. Vì lý do trên mà cần có biện pháp hạn chế mạt, thông thường các chủng giống phải được bảo quản ở nơi sạch, nhiệt độ 4-8oC.

         Tương tự như nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm men. Chúng tôi chỉ đề cập đến các phương pháp thông dụng nhất đang được sử dụng tại các bộ sưu tập nấm men lớn trên thế giới.

         a. Phương pháp cấy truyền:

         Cấy truyền là phương pháp đơn giản, nhanh và rẻ tiền cũng như thông dụng nhất, tuy nhiên những hạn chế của phương pháp này là dễ tạp nhiễm cũng như những thay đổi các đặc điểm sinh học, tính trạng di truyền sẽ là bất lợi khi bảo quản theo phương pháp này.

         Cấy truyền trên môi trường dịch thể:

-         Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường là môi trường YM Yeast extract – Maltose) trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút. Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản.

-         Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản được đưa vào môi trường bằng thao tác vô trùng và giữ ở 25oC trong 72 giờ. Phải kiểm tra sự phát triển của chủng bảo quản.

-         Sau đó các mẫu được giữ ở 4oC.

-         Thông thường theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thay đổi từ 2- 6 tháng.

Cấy truyền trên môi trường thạch:

         Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở đây môi trường được bổ sung thạch (1.6%). Giống sau khi cấy được giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 4-8oC. Theo phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống được bảo quản từ 3-6 tháng.

         Thời gian bảo quản có thể được kéo dài từ 2-3 năm nếu như các ống giống được bảo quản trong dầu parafil đã thanh trùng và được đổ lên trên môi trường thạch sao cho tạo một lớp dày khoảng 1cm.

         b. Phương pháp bảo quản trong lạnh sâu và đông khô (xem phần các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn).