Công thức hóa học chung của alkaloid nhân tropan

Trong cây thường chứa hỗn hợp nhiều alcaloid. Trong đó, alcaloid có hàm lượng cao nhất được gọi là alcaloid chính, còn những alcaloid khác hàm lượng thấp hơn thường gọi là alcaloid phụ.

• Các cây cùng họ thường chứa các alcaloid cùng nhóm.
• Một alcaloid gặp ở nhiều họ khác hẳn nhau.
• Hàm lượng alcaloid thường thấp và thay đổi theo điều kiện dinh dưỡng và sinh lý:

Đặc biệt: Canh kina (6-10%), Morphin/ nhựa thuốc phiện (20-30%) 4. Phân loại:  Theo bậc N:

• Bậc I (R-NH 2 )  không gặp.
• Bậc II (R 2 -NH), bậc III (R 3 -N):  Phổ biến nhất. H+ R 3 -N R 4 -N+ OH- (Dạng không ion hóa) (Dạng ion hóa) Base Muối Thân dầu (tan/dmkpc) Thân nước (tan/dmpc)
• Bậc IV (berberin, palmatin...)
• N-oxyd-alcaloid:
• Amid alcaloid: Trung tính: colchicin, capsaicin, ricinin,...  Theo sinh tổng hợp:
• Alcaloid thực: (N từ acid amin và thuô ̣c dị vòng)  alc chính thức
• Proto-alcaloid: (N từ acid amin và ở mạch nhánh)  tiền alc (ephedrin, capsaicin, colchicin, hordenin, mescalin...)
• Pseudo-alcaloid: (N không từ acid amin và ở dị vòng) alc giả (cafein, coniin, aconitin, conessin, solanidin...)  Theo cấu trúc hóa học: Proto-alcaloid Alcaloid thực Pseudo alcaloid alc. phenylalkylamin alc. Tropan alc. terpenoid alc. Tropolon alc. Quinolin, alc. alc. steroid

0,01%  “không có” <1%  “ít” >1% - 3%  “nhiều”

• Mô ̣t số : Nitơ bậc IV; N-oxyd. (N  O)
• Do đô ̣ âm điện của Nitơ < Oxy 
• N-H kém phân cực hơn liên kết O-H
• N.. lỏng lẻo hơn O..
• alcaloid kém phân cực hơn alcol tương ứng
• Điểm sôi của alcaloid: Thấp hơn alcol tương ứng alcol > alcaloid bậc I > alc II > alc III > ether
• Tính kiềm của alcaloid: Kiềm yếu hơn amoniac NH4OH (pKa = 9,3) > alc IV > alc I > alc II > alc III (–NR2 )  tính kiềm yếu nhất dãy.
• Tính chất
• Lý tính:  Thể chất:
• Đa số [C,H,O,N]  rắn / t O thường + Kết tinh được (trừ arecolin; pilocarpidin dạng lỏng) + Nhiệt đô ̣ nóng chảy rõ ràng (nếu bền tO)
• Thăng hoa (cafein, ephedrin)
• Đa số [C,H,O,N]  lỏng / tO thường + Bay hơi được (trừ sempervirin, conessin) + Bền nhiệt
• Cất kéo được (nicotin, coniin)

 Màu sắc: Thường không màu (trừ berberin, palmatin vàng, colchicin vàng nhạt, pyocyanin xanh, ibogain đỏ)  Mùi: Thường không mùi  Vị: Thường đắng (trừ piperin, capsaicin cay; aconitin không đắng)  Năng suất quay cực:

• Thường có khả năng quay cực (trừ piperin, papaverin)
• Thường tả thuyền (dạng L) (trừ tubocurarin, pilocarpine, cinchonin  hữu tuyền (dạng L)
• Dạng L thường có hoạt tính mạnh hơn dạng D (trừ D-tubocurarin > L- tubocurarin)  Trạng thái tự nhiên:
• Dạng base (hiếm)
• Dạng muối (đa số):
• với acid vô cơ
• với acid hữu cơ (succinic, gallic, tannic...)
• với acid hữu cơ đă ̣c biệt (meconic, tropic, aconitic...)

X

• Dạng glycosid (ít)  Độ tan:
• Alcaloid dạng base:
  • không tan trong nước
  • tan/DMHC kém phân cực  Ngoại lệ:  Cafein, coniin, colchicin, nicotin, spartein, ephedrin, pilocarpin tan trong nước  Morphin, strychnin kém tan trong ether.  Alkaloid phenol (morphin, cephaelin) tan/ dung dịch kiềm.
• Alcaloid dạng muối:
  • Dễ tan trong nước
  • Kém tan/DMHC kém phân cực  Ngoại lệ:  Berberin clorid, berberin nitrat kém tan trong nước.  Lobelin, reserpin, apoatropin lại tan/CHCl 3
• Hóa tính:  Tính kiềm của alkaloid
• Hầu hết alcaloid có tính base yếu.
• Tuy nhiên cũng có chất có tính base mạnh như: nicotin (Alcaloid có 2 Nitơ), các alcaloid có N bậc 4, N-oxyd-alcaloid.  Ngoại lệ, có những alcaloid không có phản ứng kiềm (tính base rất yếu): Colchicin, Theobromin, Ricinin
• Nếu alcaloid có 2 Nitơ (2 chức base):  Cả 2 N đều có tính kiềm: Có thể tạo 2 loại muối. Ví dụ: Quinin  Q và Q. 2HCl
• Chỉ 1 N có tính kiềm: Chỉ có thể tạo 1 loại muối. Ví dụ: Strychnin  (Str) 2 SO 4
• Alcaloid base có tính kiềm yếu hơn các kiềm vô cơ.

[alc]+.X– + OH–  [alc] + (X– /H 2 O) (muối) NH 4 OH (bs mới) (muối mới) MgO Na 2 CO 3 NaOH

 Lưu ý:

• Độ nhạy tùy thuộc vào loại thuốc thử, tùy thuộc vào loại alcaloid. Vd: + quinin và morphin nhạy với thuốc thử Valse-mayer + cafein nhạy với thuốc thử bouchardat và dragendorff
• Thuốc thử kém bền trong môi trường kiềm  định tính: sử dụng alcaloid dạng muối.
• Tủa có thể tan lại trong (tan trong ethanol, methanol  dùng thừa  kết quả sai)
• Tủa có thành phần ổn định Thuốc thử Bertrand  định lượng bằng phương pháp cân gián tiếp. Tủa tinh thể: ( vd: hình kim )
• Thuốc thử acid picric (Hager)  Phản ứng với thuốc thử đặc hiệu

Lưu ý Tác nhân: Các chất có tính oxy-hóa mạnh (acid sulfuric đđ., acid nitric đđ., sulfochromic...)

• Môi trường thực hiện thường là khan. (Hầu hết thuốc thử là acid đặc  háo nước  bắn lên người)
• Cho màu khá chuyên biệt, giúp định danh alcaloid
• Màu thường kém bền (quan sát nhanh)
• Màu thay đổi tùy các điều kiện phản ứng (to, pH và nhất là độ tinh khiết của mẫu alcaloid). Một số phản ứng màu đă ̣c hiê ̣u thông dụng
• Định tính alcaloid: ưu tiên cho kết quả nhanh vì vậy ưu tiên các bước đơn giản đến phức tạp. Trong dược liệu có chứa alcaloid hay không? Trong dược liệu có chứa alcaloid x, y, z hay không? Có phải dược liệu A, B, C hay không? Có 3 phương pháp
• Vi hóa mô: Trong dược liệu có chứa alcaloid hay không?
• Phản ứng hóa học  Thuốc thử chung: Trong dược liệu có chứa alcaloid hay không?  Thuốc thử đặc hiệu: Trong dược liệu có chứa alcaloid loại nào?
• Sắc ký: Trong dược liệu có chứa alcaloid hay không? Trong dược liệu có chứa alcaloid loại nào? Có phải dược liệu A, B, C hay không?  Vi hóa mô:
  • Alcaloid và protein đều cho tủa với thuốc thử Bouchardat (thuốc thử chung- chứa iod. Vì valse-mayer có màu trắng, dragendoff có màu nâu đỏ  khó quan sát, thuốc thử Bouchardat có màu đỏ cam nhạt  dễ quan sát trên tiêu bản)
  • không có tủa  không có alcaloid, không có protein
  • có tủa (Có protein và alcaloid)  rửa cồn tartric, tráng nước  nhỏ thuốc thử Bouchardat  Có tủa: có protein hoặc có protein và alcaloid  Không có tủa: có alcaloid
  • Alcaloid tan / cồn tartric; protein không tan / cồn tartric  Phản ứng hóa học

hưởng đến môi trường của alcaloid, ban đầu hoàn toàn là cắn base, khi hòa tan vào pha động để chạy sắc kí có thể chuyển dạng base  muối, phụ thuộc vào pKa. Khi chạy với môi trường trung tính sẽ bị ảnh hưởng và thay đổi tỷ lệ 50% alc dạng muối + 50% alc dạng base  tạo hiện tượng kéo vệt) Thêm kiềm vào bản mỏng và giấy bão hòa (không đều)  hiện nay không sử dụng. Tanin giải độc alcaloid 8. Định lượng alcaloid: 4 phương pháp

1. Phương pháp cân: kém cx nhất
2. acid – base
3. đo quang (giới thiệu)
4. Phương pháp sắc ký: chính xác nhất (giới thiệu)
5. Phương pháp cân 1 Phương pháp cân trực tiếp : chiết xong đem toàn bộ cắn đi cân, hàm lượng quá bé  sai số cao Áp dụng khi:
6. Hàm lượng hoạt chất cao, hàm lượng tạp chất ít khi 3 phương pháp kia không dùng được:
7. Không đinh lượng bằng phương pháp acid-base được (alcaloid kiềm quá yếu)
8. Alcaloid chưa rõ về cấu trúc hóa học (không biết gây ra phản ứng gì để tạo ra một chất có tính quang hoạt đi đo màu)
9. Hỗn hợp phức tạp của nhiều alcaloid (các alc tách pic không rõ ràng, không chạy HPLC được)
10. Muốn đánh giá sơ bộ về hàm lượng alcaloid Trường hợp không áp dụng: hàm lượng Alcaloid quá thấp Nhược điểm: Mức độ tin câ ̣y
11. Kém chính xác (alcaloid% quá ít; tạp thừa)
12. Khắc phục bằng phương pháp cân gián tiếp: 1 Phương pháp cân gián tiếp: cho cắn alcaloid phản ứng với thuốc thử bertrand, thu lấy tủa, làm khô  cân. Cân – khối lượng bertrand = khối lượng alcaloid (hạn chế sai số)
13. Phương pháp thể tích (PP acid- base/ PP chuẩn độ): dựa trên tính kiềm của alcaloid

2 PP chuẩn độ trực tiếp: dịch chiết base, cho acid vào, nồng độ acid phản ứng = nồng độ base 2 PP chuẩn độ gián tiếp: dịch chiết base, cho một lượng chính xác acid vào (phản ứng hết với alc base), chuẩn độ lượng thừa acid = bao nhiêu. Lấy tổng acid cho vào – lượng chuẩn độ = alcaloid dạng base Trường hợp không áp dụng: alcaloid kiềm quá yếu  Phương pháp thể tích (môi trường khan)

• Nền: AcOH băng
• Acid percloric thừa (mạnh)  gián tiếp vì Acid percloric thừa là bao nhiêu
• Chỉ thị màu: Tím tinh thể
• Áp dụng: Kể cả alcaloid kiềm quá yếu (cafein,colchicin...)
• Chính xác > phương pháp cân Tím tinh thể: Vàng lục (acid) -> xanh lục (trung tính) -> tím (kiềm) Cafein (kiềm yếu), colchicin (trung tính): trong phòng thí nghiệm lựa chọn phương pháp cân hoặc môi trường khan.
• Phương pháp đo quang: đo độ hấp phụ của bước sóng của hoạt chất đó  sử dụng định luật lambert-beer “nồng độ của hoạt chất tỷ lệ thuận với độ hấp phụ bước sóng”  áp dụng khá nhiều alcaloid, trong những trường hợp cho ra phản ứng màu đặc hiệu.
  • Màu tự nhiên (berberin-đỏ, palmatin)
  • Màu phản ứng + thuốc thử tạo màu (Dragendorff, oxy-hóa)
  • Màu huỳnh quang (quinin sulfat, berberin sulfat) Thực hiện:
  • Đo trực tiếp màu dung dịch (thường tính theo 1 alcaloid đại diê ̣n)
  • Đo bằng cách quét vết màu (scanner / SKLM) (thường chấm // alcaloid chuẩn) Trường hợp không áp dụng: Alcaloid chưa rõ về cấu trúc hóa học

4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng: không sử dụng vì không chính xác, bán định lượng: chỉ ước lượng sơ bộ hàm lượng alcaloid, không định lượng chính xác.

4ương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao:

kém phân cực trong dịch chiết  ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, ảnh hưởng đến các bước tinh chế ở sau)

• Tạp phân cực: gôm, chất nhầy, peptin, tinh bột (rễ, củ); tanin, flavonoid; acid hữu cơ, đường (quả); polyphenol, sắc tố hoa (hoa)  ưu tiên sử dụng phương pháp 3
• Dung môi ethanol, methanol: là dung môi đa năng, hòa tan cả hoạt chất phân cực và kém phân cực

 Chiết alcaloid bằng ROH (trung tính): thu được alcaloid muối có sẵn trong cây

• Làm ẩm dược liệu: để làm mềm dược liệu, dịch chiết dễ thấm vào dược liệu, dễ kéo hoạt chất bên trong dược liệu đi ra ngoài  tăng hiệu suất
• Làm ẩm bằng MeOH
• Cô quay (loại dung môi, không ảnh hưởng hết hoặt chất và tạp chất) để loại bỏ MeOH: vì MeOH là dung môi đa năng, khi lắc với DCM  không phân lớp, tạo thành dung dịch đồng nhất  không tách được alcaloid dạng base. Vì vậy phải loại hoàn toàn MeOH và sau đó lắc với nước acid.
• Bước + HCl 2% (98% là nước nên hòa tan tạp phân cực):  thu được muối mới (Acl. Clorid), tạp phân cực Lọc bỏ tủa (loại tạp kém phân cực)
• Kiềm hóa, chiết DCM: loại tạp phân cực (tạp phân cực không tan trong DCM)  Chiết alcaloid bằng cồn acid/ nước acid: thu được alcaloid muối mới (muối kết hợp với acid cho thêm vào. Muối sulfat/muối cloric/...)

Kiềm hóa  làm ẩm vừa đủ (dược liệu sẫm màu đi, đồng đều, tơi xốp). Tránh làm ẩm quá nhiều kiềm  gây cản trở dung môi hữu cơ tiếp xúc với dược liệu, làm giảm hiệu suất.  Cách xử lý khi cho kiềm quá nhiều: thêm dược liệu, dùng giấy thấm, cô bay hơi bớt kiềm.

• Chiết DMHC/kiềm: loại tạp phân cực
• Đường thẳng: trong trường hợp dược liệu chứa ít tạp kém phân cực, hoặc đã loại tạp trong các bước trước Đi vòng: loại tạp kém phân cực  Lưu ý: Chiết alcaloid base bằng Dung môi hữu cơ/kiềm
• Lựa chọn kiềm phù hợp:  Tránh dung kiềm mạnh ngay từ đầu vì có thể làm biến đổi cấu trúc của những alkaloid có tính kiềm yếu.  Kiềm có thể ảnh hưởng đến họoạt chất (phá vỡ cấu trúc, thuủ phân, racemic hóa,...) Hầu hết alkaloid có tính kiềm yếu hơn NH4OH  chủ yếu sử dụng NH4OH. Ngoại trừ:
• alcaloid base- tanin ( quinin)  phức bền  lực chọn kiềm mạnh NaOH
• Ephedrin, quinin mạnh hơn NH 4 OH  chiết xuất: dùng Na 2 CO 3 , CaO
• Nicotin, berberin base kiềm rất mạnh  chiết xuất: dùng NaOH (để chuyển dạng muối  dạng base)
• Lựa chọn dung môi phù hợp:  Nếu dùng dãy dung môi có độ phân cực tăng dần, có thể chiết riêng từng alcaloid có độ phân cực tăng dần.  Dung môi có thể phá hủy/ biến đổi alcaloid base.

Vd:

• Loại bỏ chất béo – tạp kém phân cực (tránh phản ứng với kiềm) từ đầu (hoặc không sử dụng phương pháp này): bằng cách chiết với DMHC (n-hexan, ether ethylic) trước khi kiềm hóa giữ lại dược liệu chiết với DMHC cao hơn (CHCl3).
• Nếu không loại chất béo mà đi kiềm hóa sẽ xảy ra phản ứng xà phòng hóa

Chất béo + Kiềm  Muối (xà phòng hóa)  ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất.

 Lưu ý:

• Lá (chứa diệp lục: clorophin), hạt (chất béo) chứa nhiều tạp kém phân cực  ưu tiên chiết bằng phương pháp 2 vì sử dụng phương pháp hạn chế tạp tối đa.

Ưu điểm Nhược điểm PP DMHC/kiềm - Áp dụng phổ biến với hầu hết alcaloid.

• Có tính chọn lọc, alcaloid base thu được khá sạch.
• Rất thích hợp cho kiểm nghiê ̣m.
• Tốn nhiều dung môi, dung môi đô ̣c hại.
• Khó áp dụng ở quy mô lớn (thiết bị, thời gian).
• Bã sau khi chiết có thể gây ô nhiễm môi trường.

PP Cồn acid - Áp dụng phổ biến với hầu hết alcaloid.

• Dung môi không độc hại
• Chi phí rẻ
• Áp dụng ở quy mô lớn
• Bã ít gây ô nhiễm môi

-Không có tính chọn lọc, alcaloid base thu được còn chứa nhiều tạp chất.

• Không thích hợp cho kiểm nghiê ̣m.

CÁC TRƯỜNG HỢP ĐẶC BIỆT

 Morphin: có tính acid yếu (-OH phenol), không tan trong ether. Morphin + Kiềm mạnh (Ca(OH) 2  tạo phức phenolat với Ca (muối tan / DMPC) + Kiềm yếu (pH 9-10)  base

Nhựa thuốc phiện cho vào nước sôi  kiềm hóa bằng CaO (tạo phức phenolat với Ca  tan được trong dịch chiết 1 (nước)) Loại bỏ tủa (bã dược liệu) Dịch chiết (có tính kiềm mạnh) + NH4Cl (tính base)  dung dịch có tính kiềm yếu hơn. ( dùng muối có tính base, không dùng acid vì có thể ảnh hưởng đến các hoạt chất khác) NH4Cl + Ca(OH)2  CaCl2 + NH4OH (giảm độ kiềm của dung dịch) Morphin Calci  Morphin base ( không tan/ dm H2O, để nguội  tủa lại) Lọc  giữ tủa lại (Morphin base). Morphin base + HCl  Morphin tinh khiết  Berberin: (N bậc IV  dạng ion  phân cực  tan/DMPC và tính kiềm mạnh)