Matrix Metalloproteinases là gì
Ngày đăng:
17/12/2021
Trả lời:
0
Lượt xem:
146
Nghiên cứu biểu hiện gen matrix metalloproteinase-9 (mmp-9) của người ở e. coli
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------------------------------------- NGUYỄN THỊ DUNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) CỦA NGƢỜI Ở E. COLI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Hà Nội - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Lê Thị Bích Thảo, trưởng phòng Hóa sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học, người thầy đã luôn hướng dẫn, định hướng và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Thái Nguyên cũng như các thầy cô thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy và truyền thụ cho tôi kiến thức chuyên môn để thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cô chú, các anh chị phòng Hóa sinh Protein đã hướng dẫn tận tình, dạy tôi những kiến thức thực hành trong phòng thí nghiệm. Đặc biệt là Th.S Bùi Thị Huyền người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi từng bước từ khi mới bắt đầu thực tập, cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, và cho tôi những lời khuyên quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ những người sinh thành, nuôi dưỡng tôi là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới anh chị, bạn bè tôi đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Một lần nữa tôi vô cùng cảm ơn. Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu a.a Tên Tiếng Anh Amino acid Tên Tiếng Việt Axit amin Amp+ Ampicilin Ampicilin APS Amonium persulphate Muối amonium persulphate bp Base pair Cặp bazơ DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleoside triphosphate E. coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli ECM Extracellular matrix Chất nền ngoại bào EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide EtOH Ethanol Cồn ethanol IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside Isopropyl-thio-β-D-galactoside Kb Kilo base 1000 cặp bazơ (1000 bp) kD Kilo Dalton Kilo Dalton LB Luria - Bertani Môi trường LB MMPs Matrix metalloproteinases Metalloproteinases cơ chất mRNA Messenger RNA RNA thông tin MT-MMPs Membrane-type MMPs MMPs dạng màng PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp rRNA Ribosomal ribonucleic acid RNA ribosome SDS Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis Điện di biến tính trên gel polyacrylamide TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA TEMED N, N, N, N-Tetramethyl Ethylendiamine N, N, N, N-Tetramethyl Ethylendiamine Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................................... i NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................................. iii MỤC LỤC........................................................................................................................................ iv DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN...................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ..................................................... vii MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................... 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về Matrix metalloproteinases (MMPs) ............................................................ 3 1.1.1. Phân loại và cấu trúc MMPs ..................................................................................... 3 1.1.2. Chức năng sinh học của MMPs ................................................................................. 9 1.2. Tổng quan về Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) ....................................................... 10 1.2.1. Cấu trúc gen MMP-9 ............................................................................................... 11 1.2.2. Cấu trúc protein MMP-9 .......................................................................................... 12 1.2.3. Sự kích hoạt MMP-9 ................................................................................................ 15 1.2.4. Chức năng sinh học của MMP-9.............................................................................. 15 1.3. Tiềm năng ứng dụng của MMP-9 trong y học ................................................................. 17 1.3.1. Tiềm năng là chỉ thị sinh học trong chẩn đoán các bệnh về tim mạch .................... 17 1.3.2. Tiềm năng là chỉ thị sinh học cho các bệnh lý khác ................................................. 20 1.4. Tình hình nghiên cứu MMP-9 ở Việt Nam ...................................................................... 20 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 22 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc ............................................................................. 22 2.2. Phương pháp .................................................................................................................... 24 2.2.1. Tách chiết RNA tổng số ............................................................................................ 24 2.2.2. Tổng hợp cDNA........................................................................................................ 24 2.2.3. Nhân gen MMP-9 bằng phản ứng PCR ................................................................... 25 2.2.4. Phương pháp ghép nối DNA .................................................................................... 26 2.2.5. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ..................................... 27 2.2.6. Tách chiết DNA plasmid .......................................................................................... 28 2.2.7. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ............................................................ 29 2.2.8. Thôi gel bằng kit QIAquick Gel Extraction .............................................................. 29 2.2.9. Xác định trình tự DNA ............................................................................................. 30 2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho MMP-9 .................................................. 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 2.2.11. Biểu hiện gen mã hóa cho protein MMP-9 .............................................................. 31 2.2.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE ................................................ 31 2.2.13. Kỹ thuật Western blot ............................................................................................... 32 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 34 3.1. Kết quả tách dòng gen mã hoá cho MMP-9 ..................................................................... 34 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số ............................................................................................ 34 3.1.2. Nhân gen mã hoá cho MMP-9 bằng phản ứng PCR ................................................ 34 3.1.3. Tách dòng và xác định trình tự gen MMP-9 ............................................................ 36 3.2. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho MMP-9 .......................................................... 43 3.3. Biểu hiện gen MMP-9 ở vi khuẩn E. coli BL21(DE3) .................................................... 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Tiêu đề Bảng 1.1 Phân loại Matrix metalloproteinases 4 Bảng 1.2 Vai trò của MMPs 9 Bảng 1.3 Trang Đa hình gen liên quan tới sự biểu hiện tăng của MMP-9 và bệnh tim mạch 18 Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi 22 Bảng 2.2 Hóa chất và enzyme 23 Bảng 2.3 Máy móc và thiết bị 23 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối ghép 26 Bảng 2.6 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 28 Bảng 2.7 Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE 32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Hình Tiêu đề Trang Hình 1.1 Đặc điểm cấu trúc của một số phân nhóm MMPs 8 Hình 1.2 Vị trí các yếu tố phiên mã trên promoter của gen mã hóa cho MMP-9 11 Hình 1.3 Cấu trúc ba chiều của MMP-9 14 Hình 3.1 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách RNA tổng số 34 Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ cDNA mã hóa cho MMP-9 36 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA plasmid các dòng khuẩn lạc Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI Kết quả điện đi kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc đã chọn lọc 37 38 39 Hình 3.6 Kết quả xác định trình tự gen MMP-9 39 Hình 3.7 Kết quả so sánh trình tự protein MMP-9 42 Hình 3.8 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện của gen mã hóa cho MMP-9 44 Hình 3.9 Kết quả điện di kiểm tra đoạn gen và vector sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn 45 Hình 3.10 Sơ đồ enzyme giới hạn NcoI và EcoRI của vector MMP9-pCR2.1 46 Hình 3.11 Kết quả điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp cho biểu hiện MMP-9 47 Hình 3.12 Kết quả biểu hiện protein điện di trên gel polyacrylamide 12.5% 48 Hình 3.13 Kết quả kiểm tra protein biểu hiện bằng phản ứng Western blot với kháng thể kháng MMP-9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii 49 MỞ ĐẦU Ngày nay, quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa làm thay đổi hàng loạt các yếu tố môi trường, tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến sức khoẻ con người. Đồng thời áp lực cuộc sống và công việc cũng góp phần không nhỏ ảnh hưởng xấu tới con người làm gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh lý nghiêm trọng như tiểu đường, các bệnh về tim mạch, ung thư, rối loạn gây suy thoái thần kinh hay các bệnh về xương khớp đe dọa tới tính mạng con người. Tuy nhiên, với những tiến bộ mới của y học hiện nay có thể giúp chẩn đoán sớm và đưa ra nhiều phương pháp điều trị hiệu quả, góp phần kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lượng sống cho bệnh nhân. Trong đó, phương pháp chẩn đoán sớm sử dụng chỉ thị sinh học (biomarkers) để tiên lượng sẽ hỗ trợ bác sĩ đưa những phương pháp điều trị thích hợp. Genomics và proteomics là các kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán sớm. Nghiên cứu về các gen và protein có chức năng liên quan đến những biến đổi trạng thái bệnh lý khác nhau đang được chú trọng đầu tư ở nhiều quốc gia trên thế giới. Trong số các protein được quan tâm, Matrix metalloproteinases (MMPs) là một họ protein endopeptidases kẽm được điều hoà chặt chẽ, có thể bất hoạt các protein ngoại bào đồng thời tái tạo lại các mô liên kết ở cả trạng thái bình thường như sự phát triển phôi, sinh sản và tái tổ hợp mô cũng như trạng thái bệnh sinh như ung thư di căn, viêm mãn tính, các bệnh về tim mạch, tổn thương mô cũng như rối loạn về thần kinh (Klein and Bischoff, 2011). Do đó, MMPs được coi là chỉ thị sinh học trong chẩn đoán, tiên lượng và kiểm tra các bệnh khác nhau như bệnh tiểu đường, bệnh tim mạch, ung thư, rối loạn gây suy thoái thần kinh và nhiễm trùng (Galliera et al, 2014). Họ matrix metalloproteinases gồm sáu phân nhóm, trong phân nhóm gelatinase MMP-9 (gelatinase B) có các chức năng chủ yếu trong việc phá vỡ mạng lưới ngoại bào, có thể phá huỷ nhiều loại protein ngoại bào bao gồm gelatin, collagen type IV và nhiều protein màng. MMP-9 được điều hoà chủ yếu ở mức độ phiên mã và sau dịch mã bằng sự kích hoạt của zymogen và sự ức chế của chất ức -1- chế nội sinh TIMP-1. Đã có nhiều nghiên cứu về MMP-9, đặc biệt là tiềm năng làm chỉ thị sinh học trong chẩn đoán sớm các bệnh lý như tim mạch, viêm (Halade et al, 2013), loạn dưỡng cơ Duchene (Nadarajah et al, 2011), ung thư tuyến tiền liệt (Gong et al, 2014) Vì vậy, MMP-9 ngày càng được chú trọng nghiên cứu ứng dụng làm nhân tố chỉ thị cho chẩn đoán trước và trong giai đoạn điều trị bệnh. Với mục tiêu đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu biểu hiện gen Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) của ngƣời ở E. coli nhằm tạo ra được protein tái tổ hợp matrix metalloproteinase-9 của người để phục vụ cho các nghiên cứu tạo kháng thể kháng MMP-9, hỗ trợ chẩn đoán bằng các phương pháp sinh học hiện đại như thấm miễn dịch, hoá mô miễn dịch, Western Blot. -2- CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về Matrix metalloproteinases (MMPs) Matrix metalloproteinases (MMPs) là một họ protein endopeptidases phụ thuộc kẽm, đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như sự tạo phôi, tăng sinh tế bào, tái tạo mô, làm lành vết thương, sự hình thành mạch, Năm 1962, MMPs lần đầu tiên được phát hiện bởi Jerome Gross và Charles M. Lapiere khi nghiên cứu n sự suy thoái của collagen xoắn bậc ba trong biến thái của đuôi nòng nọc (Gross and Lapiere, 1962). Năm 1968, enzyme này lần đầu tiên được phân lập từ tế bào da người ở dạng không hoạt động là proMMP (còn được gọi là zymogen MMP) (Eisen et al., 1968). Sau đó MMPs được tìm thấy ở động vật không xương sống và thực vật. Đến năm 1990 một nhóm nghiên cứu khác đã phát hiện ra cơ chế điều hòa các enzyme MMPs ở dạng không hoạt động (Van Wart and Birkedal-Hansen, 1990). 1.1.1. Phân loại và cấu trúc MMPs Phân loại Phân lớp metalloproteases là một họ protein endopeptidases bao gồm các enzyme xúc tác phụ thuộc vào kẽm (William and Robert, 1998). Matrix metalloproteinase (MMPs) thuộc phân họ matrixin kẽm Metalloprotease M10 (Nagase et al., 2006; Sbardella et al., 2012), có cơ sở dữ liệu trên MEROPS (http://www.merops.sanger.ac.uk/). Sau khi hoàn thành việc giải mã trình tự bộ gen người vào năm 2003 thì MMPs được xác định gồm 24 gen mã hóa cho toàn bộ MMPs ở người. Thành viên trong họ MMPs giống nhau khoảng 40% về cấu trúc chính. Khoảng hơn 20 loại MMPs khác nhau được phát hiện và phân loại dựa vào vị trí trên nhiễm sắc thể và dựa vào các loại chất nền. Mặc dù các tên gọi từ MMP-1 đến MMP-28 được sử dụng để phân loại, nhưng một số MMP vẫn chưa được xác định. Danh sách MMPs được thể hiện trong hệ thống Bảng 1.1 (Zitka et al., 2010). -3- Bảng 1.1. Phân loại Matrix metalloproteinases (Zitka et al., 2010) MMP MMP-1 Metalloproteinase Collgenase (type I, interstitial) kDa EC 43 EC 3.4.24.7 Locus Chất nền 11q22- Collagens (I,II,III,VIII và X); gelatin; aggrecan; L-selectin; q23 IL-1β proteoglycanes;entactin; ovostatin; MMP-2, MMP-9 Gelatinase A 72kDa MMP-2 Gelatinase type IV Collagenase Stromelysin-1 Collagens (I,IV,V,VII,X,XI và XVI); gelatin; elastin; 66 EC3.4.24.24 16q13 MMP-1; MMP-9, MMP-13 Collagens (III,IV,V và IX); gelatin; aggrecan; perlecan; 46 MMP-3 fibronectin; aggrecan; MBP; osteonectin; laminin-1; EC3.4.24.17 11q23 Proteoglykanase decorin; laminin; elastin; casein; osteonectin; ovostatin; antactin; plasminogen; MBP; IL-1β; MMP-2/TIMP-2; MMP-7; MMP-8; MMP-9; MMP-13 Collagens (IV và X); gelatin; aggrecan; decorin; elastin; MMP-7 Matrilysin 20 EC3.4.24.23 11q21- fibronectin; laminin; entactin; casein; transferrin; MBP; q22 plasminogen; β4-integrin; MMP-1; MMP-2; MMP-9; MMP-9/TIMP-1 MMP-8 Neutrophil collagenase 58 EC3.4.24.34 11q21- Collagens (I,II,III,V,VII,VIII và X); gelatin; aggrecan; q22 fibronectin -4- MMP-9 Gelatinase B 92 EC3.4.24.35 MMP-10 Stromelysin-2 46 E3.4.2.2 MMP-11 Stromelysin-3 44 No match 45 EC3.4.24.65 MMP-12 Macrophage metaloelastase 20q11.2- Collgens (IV,V,VII,X và XIV); gelatin; entactin; aggrecan; q13.1 elastin; fibronectin; osteonectin; plasminogen; MBP; IL-1b 11q22.3- Collagens ( III-V); gelatin; casein; fibronectin; vitronecin; q23 laminin; ectactin; MBP; fibrinogen; fibrin;plasminogen 22q11.2 Unknow (có thể là casein) 11q22.2- Colagen IV; gelatin; elastin; caein; fbronectin; vitronectin; q22.3 11q2.3 laminn; ectactin; MBP; fibrinogen; fibrin; plasminogen Collagens (I,II,III,IV,IX,X và XIV); gelatin; plasminogen; MMP-13 Collagenase-3 55 No match MMP-14 MT1-MMP 54 No match MMP-15 MT2-MMP 61 No match MMP-16 MT3-MMP 55 No match 8q21 Collagens III; gelatin; casein; fibronectin; MMP-2 MMP-17 MT4-MMP 54 No match 12q24 Unknow MMP-18 Collagenase-4 No match Unknow Collagens(I,II,III,VIII và X); gelatin; aggrecan MMP-19 RASI-1 No match 12q14 aggrecan; perlecan; fibronectin; osteonetin; MMP-9 14q11- Collagens (I-III); gelatin; casein; fibronectin; laminin; q12 vitronectin;entactin; proteoglycans; MMP-2; MMP-13 16q12.2q21 -5- Fibronectin; entactin; laminin; perlekan; MMP-2 Gelatin; aggrecan; fibronectin MMP-20 No match Unknow Amelogrenein; aggrecan MMP-21* No match 1p36.3 Unknow MMP-22* No match 1p36.3 Unknow MMP-23* No match Unknow Unknow No match 20q11.2 Unknow No match 16p/3.3 Pro-gelatinase A; fibrin; fibronectin; collagen IV; gelatin No match Unknow Gelatin I; P1; fibrinogen; fibronectin; vitronectin No match 17q11.2 MMP-24* MMP-25 MMP-26 MMP-28 Enamelysin MT5-MMP Leokolysin/MT6MMP Endometase, matrilysin-2 Epilysin Casein (*: Gen MMP được tìm thấy trên nhiễm sắc thể nhưng chức năng và cấu trúc của chúng chưa được xác định) -6- Cấu trúc MMPs là những protein có cấu trúc tương đồng nhau, có thể chia thành 6 nhóm chính: collagenases, stromelysins, matrilysins, gelatinases, MT-MMPs (Membrane-type MMPs) và MMPs không có nhóm chỉ định. Dựa vào nghiên cứu tinh thể học và cộng hưởng từ có thể xác định được cấu trúc của nhiều MMPs. MMPs là endopeptidases phụ thuộc kẽm và canxi, được tổng hợp dưới dạng proMMPs và được tiết ra ngoài tế bào nhưng ở dạng bất hoạt (trừ MT-MMPs) (Zitka et al., 2010). Hầu hết các MMPs có cấu tạo gồm ba vùng chính: vùng propeptide, vùng xúc tác (CAT) và vùng hemopexin-like (HPX) (Page-McCaw et al., 2007; Ndinguri et al., 2012). Vùng signal peptide nằm ở đầu gần vùng propeptide, là đoạn peptide chứa khoảng 17-20 amino acid (a.a), có vai trò trong đáp ứng tín hiệu tiết. Vùng signal peptide có ở tất cả các MMPs trừ MMP-17 (William and Robert, 1998). Vùng propeptide gồm khoảng 80 a.a, chức năng của vùng này tạo ra các zymogen, vùng propeptide khi bị phân cắt sẽ kích hoạt proMMP (Zitka et al., 2010). Vùng hemopexin-like (hay còn được gọi là vùng C-terminal) có cấu trúc tương tự với protein họ hemopexin, gồm khoảng 200 a.a. Vùng này có diện tích bề mặt tương đối lớn cho các tương tác giữa protein với protein. Chức năng của vùng này chưa được biết rõ (Zitka et al., 2010). Vùng xúc tác gồm khoảng 170 a.a, với 2 ion kẽm (Zn2+) và 2 hoặc 3 ion canxi (Ca2+) trong trung tâm hoạt động. Ion Zn2+ đầu tiên nằm ở vị trí hoạt động tham gia trực tiếp vào quá trình xúc tác. Ion Zn2+ thứ hai (kẽm cấu trúc) và ion Ca2+ cách ion Zn2+ xúc tác một khoảng 12 nm. Chức năng của các ion Ca2+ là ổn định cấu trúc của vùng xúc tác (Massova et al., 1998; Zitka et al., 2010). -7- Hình 1.1. Đặc điểm cấu trúc của một số phân nhóm MMPs (Gong et al., 2014) Trong đó: SP (vùng signal peptide), Pro-domain (vùng propeptide có nhóm thiol [SH]), Catalytic domain (vùng xúc tác có vị trí liên kết Zn2+), Hinge (bản lề), Hemopexin-like (vùng hemopexin), F (fibronectin type II), Fr (vị trí nhận diện furin), Transmembrane (vùng chuyển màng) hoặc GPI (liên kết glycosylphosphatidylionositol), Cys (vùng cysteine), IgG-like (vùng tượng tự Immunoglobulin) -8- 1.1.2. Chức năng sinh học của MMPs Vai trò chính của MMPs là phân hủy và loại bỏ các phân tử chất nền ngoại bào (extracellular matrix-ECM) từ các mô (Nagase et al., 2006; Ogura et al., 2014). Các nghiên cứu sâu hơn chỉ ra rằng sự phân hủy chất nền ngoại bào hoặc các phần tử bề mặt tế bào làm thay đổi tương tác giữa cơ chất-tế bào và tế bào-tế bào. Khi các nhân tố sinh trưởng được tạo thành, chúng liên kết với ECM làm cho các nhân tố sinh trưởng này có khả năng nhận diện thụ thể tế bào. Một số phân tử không phải chất nền ngoại bào cũng là cơ chất tiềm năng của MMPs (Nagase et al., 2006). Trong điều kiện sinh lý bình thường MMPs bị kiểm soát chặt chẽ bởi các chất ức chế nội sinh TIMPs (Tissue inhibitors of metalloproteinases). Do vậy, sự mất cân bằng giữa MMPs và TIMPs có thể làm tăng hoạt động của phân tử MMPs dẫn đến trạng thái bệnh lý nào đó. MMPs còn tham gia vào nhiều quá trình sinh học và bệnh lý (Bảng 1.2) như ung thư di căn, viêm khớp dạng thấp, thoái hóa khớp, các bệnh về tim mạch (William and Robert, 1998; Klein and Bischoff, 2011; Jones, 2014). Bảng 1.2. Vai trò của Matrix metalloproteinases (William and Robert, 1998) Trạng thái bình thường Trạng thái bệnh Sự phát triển Phá hủy mô Làm tổ của phôi Viêm khớp dạng thấp Phát triển phôi thai Thoái hóa khớp Sự phát triển thần kinh Ung thư di căn Loại bỏ tấm sụn tăng trưởng Chứng thối loét vì nằm liệt giường Sự phát triển xương Viêm loét dạ dày Hình thành men răng Viêm loét giác mạc Sự tiêu gốc răng Bệnh nha chu Bệnh xơ hóa Sự sinh sản Chu kỳ niêm mạc tử cung Bệnh xơ gan Vỡ nang buồng trứng Bệnh xơ hóa phổi Tan thể vàng Chứng xơ cứng tai -9- Mở cổ tử cung Xơ vữa động mạch Co hồi tử cung sau sinh Bệnh đa xơ vữa Sự phát triển tuyến vú Co hồi tuyến vú Vỡ màng ối Suy giảm cơ chất Duy trì sự cân bằng Phục hồi hệ xương Bệnh dãn nở cơ tim Chu trình nang lông Bong biểu bì bọng nước Chữa lành vết thương Phình động mạch chủ Sự tạo mạch Apoptosis Tái tạo tế bào thần kinh Chức năng đại thực bào Chức năng bạch cầu trung tính 1.2. Tổng quan về Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) thuộc phân nhóm gelatinases, có kích thước khoảng 92 kDa, protein MMP-9 (EC 3.4.24.35) còn có các tên gọi khác là collagenase type IV 92 kDa, gelatinase 92 kDa và gelatinase B. MMP-9 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1974 bởi Sopata và Dancewicz khi tinh chế một protease từ bạch cầu trung tính của người có khả năng biến tính collagen (gelatins) (Sopata and Dancewicz, 1974). Hoạt tính phân giải gelatin và collagen (type IV và V) của protease này được nhận biết từ môi trường nuôi cấy xương thỏ (Murphy et al., 1981) và bạch cầu trung tính của người (Murphy et al., 1982), protease này được xác định thuộc họ MMPs có kích thước khoảng 90-110 kDa. Các hoạt tính tượng tự của phân tử protease có kích thước 82-97 kDa cũng được phát hiện ở bạch cầu trung tính của lợn (Murphy et al., 1989). Hàng loạt các nghiên cứu đã chứng minh có hai loại protease với kích thước 72 kDa và 92 kDa có khả năng phân hủy collagen type IV, V và gelatin thuộc họ MMPs. Tại hội nghị The Destin Beach matrix - 10 - metalloproteinases năm 1989 quy ước protease có kích thước 92 kDa này là MMP9 (William and Robert, 1998). 1.2.1. Cấu trúc gen MMP-9 Ở người, gen mã hóa cho MMP-9 có vị trí trên nhiễm sắc thể 20q11.2-q13.1, có kích thước 7654 bp, gồm 13 exon xen giữa 12 intron. Kích thước mỗi exon có thể dao động từ 104 bp (exon 12) đến 280 bp (exon 9) và kích thước mỗi intron khoảng 96 bp (intron 11) đến 1800 bp (intron 12) (William and Robert, 1998). Promoter của MMP-9 khoảng 2.2 kb, giống với MMP-1 và MMP-3 hơn là MMP-2 bao gồm: Hộp TATA ở vị trí -29, không có hộp CCAAT, một liên kết Sp1 với hộp GC ở vị trí -563 và Sp1 cũng liên kết với hộp GT ở vị trí -54, yếu tố kìm hãm TGFβ ở vị trí -474, yếu tố AP-1 ở vị trí -79 và -533, ba liên kết PEA3/Ets có vị trí ở giữa khoảng -599 và -531, yếu tố NF-κB ở vị trí -600 và -328, có hai yếu tố AP-2 và một đoạn (CA)n (Hình 1.4) (Van den Steen et al., 2002; Farina and Mackay, 2014). Hình 1.2. Vị trí các yếu tố phiên mã trên promoter của gen mã hóa cho MMP-9 (Farina and Mackay, 2014) Trong đó: E2 BS ( E2 protein), NF-κB (nuclear factor-kappa binding), Sp1 (specific protein-1), ETS (E26 transformation specific), (CA)n (vùng CA lặp lại), AP-1 (activator protein-1), GTbox và TATA box (hộp GT và hộp TATA) Quá trình phiên mã của MMP-9 được kiểm soát bởi nhiều yếu tố gồm: yếu tố phiên mã E-26 (Ets), NF-κB, PEA3, AP-1, Sp1 và (SAF)-1. Est là một họ các yếu tố phiên mã gắn liền với một loạt các chức năng sinh học như biệt hóa tế bào, di cư tế bào, tăng sinh, quá trình apoptosis và hình thành mạch. NF-κB có khả năng liên kết với κB DNA trên promoter hoặc enhancer của gen để điều hòa biểu hiện gen. - 11 - Theo báo cáo của Bond và cộng sự thì MMP-9 có mức biểu hiện tăng trong các tế bào cơ trơn ở mạch máu thông qua yếu tố NF-κB (Bond et al., 2001). Khi NF-κB bị ức chế thì nồng độ MMP-9 trong các tế bào cơ trơn và đại thực bào giảm (Bond et al., 2001; Grimm et al., 2006). Hai vị trí liên kết với yếu tố AP-1 nằm trên vùng promoter có chức năng kích hoạt MMP-9 khi nồng độ protein AP-1 tăng nhanh. Yếu tố Sp1 gắn với promoter của MMP-9 để kích hoạt sự phiên mã. Sự ức chế của Sp1 dẫn đến giảm biểu hiện MMP-9. Ngoài ra, các yếu tố phiên mã này còn tương tác để điều hòa biểu hiện MMP-9 (Yabluchanskiy et al., 2013). 1.2.2. Cấu trúc protein MMP-9 MMP-9 là một metallo-enzyme đa vùng, vị trí xúc tác bao gồm một vùng liên kết kim loại tách biệt với vùng hoạt động bằng ba chuỗi fibronectin liền nhau, thuận lợi cho phân hủy cơ chất có kích thước lớn như elastin và biến tính collagens. Trong vùng xúc tác, các a.a Asp309, Asn319, Asp232, Tyr320 và Arg3076 đóng vai trò quan trọng trong gắn gelatin. Enzyme này duy trì hoạt động bằng vùng propeptide đầu N PRCGXPD, có gốc cysteine liên kết với ion Zn2+. Đầu C của MMP-9 chứa một vùng hemopexin-like kiểm soát sự liên kết cơ chất, tương tác với chất ức chế và tạo điều kiện thuận lợi cho các liên kết bề mặt. Vùng liên kết O-glycosyl nằm giữa giúp cho MMP-9 linh động hơn, ngoài ra vùng này còn tham gia vào nhiều quá trình như kiểm soát đặc hiệu cơ chất cũng như quá trình xâm nhập của MMP-9, quá trình tương tác với TIMP và định vị trên bề mặt tế bào. Vùng này tạo điều kiện cho hoạt động của MMP-9 với các đại phân tử, tháo rỡ và phân tách collagen bằng các enzyme khác, cho phép MMP-9 là chất phân hủy trung gian (Van den Steen et al., 2002; Vandooren et al., 2013; Farina and Mackay, 2014). Đặc điểm vùng cấu trúc protein của MMP-9: Vùng xúc tác: Trong vùng này a.a Glu402 và ion Zn2+ là các yếu tố cần thiết để thực hiện chức năng trong khi a.a Lue397 và Ala406 đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác nói chung, Asp410, Pro415 tăng hoạt động phân hủy - 12 - colagen type V và gelatin (OFarrell and Pourmotabbed, 2000), sự thay thế Gly cho Glu415 giúp MMP-9 phân hủy được collagen (OFarrell et al., 2006). Vùng propeptide có chứa công tắc cysteine (cysteine switch) liên kết với ion Zn2+ ức chế hoạt động xúc tác của MMP-9. Vùng Hemopexin-like: Đặc trưng của vùng là cấu trúc cộng hóa trị khá đặc biệt, trong đó Cys516 và Cys704 tạo thành một cầu nối disulfide, cầu nối này tham gia vào vùng chức năng nhưng không cần thiết cho quá trình bài tiết của MMP-9 (Dufour et al., 2011; Khan et al., 2012). Vùng hemopexin-like tương tác với cơ chất để oligomer hóa và khi tương thích với cơ chất như heme thì vùng này có khả năng kích hoạt MMP-9. Cầu nối disulfide trong chuỗi fibronectin rất cần cho sự bài tiết của MMP-9 (Farina and Mackay, 2014). Vùng O-glycosyl (vùng bản lề - hinge): là vùng giống collagen type V, đặc trưng bởi 64 a.a liên kết với 22 gốc proline, 6 gốc glycine và từ 12-14 liên kết Oglycosidic. Vùng này có chức năng định hướng cho hoạt động của vùng hemopexinlike, rất quan trọng trong tương tác với protein ngoại sinh (các cơ chất của MMP-9) (Van den Steen et al., 2006; Farina and Mackay, 2014). Nếu loại bỏ vùng này sẽ giảm độ đặc hiệu của MMP-9 với các đại phân tử cơ chất bao gồm cả gelatin (Vandooren et al., 2013). - 13 - Tải về bản full
|